Attività enzimatica e curva di calibrazione

Salve a tutti, avrei un dubbio riguardo un protocollo da laboratorio che abbiamo seguito all'università per 6 settimane.

Gli esperimenti riguardano la reazione tra la fosfatasi alcalina e il p-nitrofenolo e sono 5: la prima parte chiede di preparare sette campioni a diverse concentrazioni di p-nitrofenolo con soluzione tampone e di misurarne l'assorbanza per tracciare una curva di calibrazione con i valori di assorbanza. Gli altri esperimenti sono: "Misurazione dell'attività dell'enzima fosfatasi alcalina", "L'effetto della concentrazione del substrato sulla velocità di reazione", "L'effetto del pH sull'attività dell'enzima" e "L'effetto della temperatura sulla reattività". Per ognuno di questi esperimenti si richiede di calcolare la quantità di prodotto o di enzima tramite spettroscopia e tracciare grafici tenendo conto della curva di calibrazione che doveva essere tracciata (ovviamente dopo aver eseguito l'esperimento nuovamente) ogni settimana. 

Il punto è questo: perchè si deve tener conto della curva di calibrazione per i risultati degli altri esperimenti? Ad esempio, se costruisco un grafico con ascissa=valore di assorbanza e ordinata=volume di nitrofenolo e traccio la curva di calibrazione, in che modo ne devo tenere conto quando, dopo aver svolto l'esperimento n° 4 (effetto della concentrazione del substrato sulla velocità di reazione) mi viene richiesto di "determinare la quantità di p-nitrofenolo prodotto per minuto, nei 10 minuti di incubazione di ogni tubo"? Oppure ancora, quando dopo aver eseguito l'esperimento 3 mi viene richiesto di "preparare una tabella dei risultati, includento la quantità di p-nitrofenolo prodotto (usando la curva di calibrazione del p-nitrofenolo)"?

Purtroppo questa materia è fatta solo di pratica e niente lezioni teoriche, quindi forse sarà scontato per chi ha studiato biochimica, ma non per me che sto seguendo questa materia in erasmus senza aver mai aperto un libro di biochimica   vi ringrazio in anticipo per l'aiuto. 

Magari postare nel luogo giusto?

Posso rispondere o devo aspettare che l'utente posti la domanda nella sezione corretta?

Il thread è nella sezione corretta perché Beef l'ha spostato

La fosfatasi alcalina (ALP) è un isoenzima, che, a pH alcalino, catalizza la reazione di idrolisi dell'p-nitrofenilfosfato (p-NPP) secondo la seguente reazione:

Il p-NPP è incolore a qualsiasi valore di pH, mentre il p-nitrofenolo (debole acido organico) è incolore a pH<5,6 e giallo a pH>7,6.

Perciò, preparando soluzioni a diversa concentrazione di p-nitrofenolo in ambiente tamponato leggermente basico, l'intensità del colore giallo delle soluzioni è direttamente proporzionale all'Assorbanza; riportando in grafico i valori di Assorbanza (in ordinata) in funzione della concentrazione delle soluzioni di p-nitrofenolo (in ascissa) si ottiene una retta denominata curva di taratura o di calibrazione.

Ogni volta che si va a determinare uno dei fattori che influenzano l'attività catalitica dell'ALP si va a misurare l'assorbanza delle soluzioni in cui si è prodotta una quantità variabile di p-nitrofenolo che viene determinata mediante la curva di taratura precedentemente costruita.

Determinazione dell'attività specifica: si preparano soluzioni a diversa concentrazione di enzima in soluzione tampone a pH leggermente basico, si addiziona ad ognuna la stessa quantità di substato in eccesso, si incuba ogni tubo per lo stesso tempo a temperatura costante, quindi si misura l'assorbanza di ogni soluzione che sarà proporzionale alla quantità di p-nitrofenolo che si è formato. La quantità di p-nitrofenolo che si è formata in ogni tubo viene ricavata dalla curva di taratura precedentemente costruita. Si riportano in grafico le concentrazioni di p-nitrofenolo che si formano in 1 minuto in ordinata in funzione della concentrazione di enzima in ascisse: l'attività dell'enzima è la quantità di p-nitrofenolo che si forma in 1 minuto da 1 mg di enzima.

Effetto della concentrazione del substrato sulla velocità di reazione: si preparano soluzioni a diversa concentrazione di substato in soluzione tampone a pH leggermente basico, si addiziona ad ognuna la stessa quantità di enzima, si incuba ogni tubo per lo stesso tempo a temperatura costante, quindi si misura l'assorbanza di ogni soluzione che sarà proporzionale alla quantità di p-nitrofenolo che si è formato. La quantità di p-nitrofenolo che si è formata in ogni tubo viene ricavata dalla curva di taratura precedentemente costruita. Si riportano in grafico le concentrazioni di p-nitrofenolo che si formano in 1 minuto in ordinata in funzione della concentrazione del substrato in ascisse.

Effetto del pH sulla velocità di reazione: si preparano soluzioni tampone a diverso pH, si addiziona ad ognuna la stessa quantità di enzima e la stessa quantità di substrato in eccesso, si incuba ogni tubo per lo stesso tempo a temperatura costante, quindi si misura l'assorbanza di ogni soluzione che sarà proporzionale alla quantità di p-nitrofenolo che si è formato. La quantità di p-nitrofenolo che si è formata in ogni tubo viene ricavata dalla curva di taratura precedentemente costruita. Si riportano in grafico le concentrazioni di p-nitrofenolo che si formano in 1 minuto in ordinata in funzione del pH in ascisse.

Effetto della temperatura sulla velocità di reazione: si preparano soluzioni contenenti la stessa quantità di enzima e la stessa quantità di substrato in eccesso, si incuba ogni tubo per lo stesso tempo a diverse temperature, quindi si misura l'assorbanza di ogni soluzione che sarà proporzionale alla quantità di p-nitrofenolo che si è formato. La quantità di p-nitrofenolo che si è formata in ogni tubo viene ricavata dalla curva di taratura precedentemente costruita. Si riportano in grafico le concentrazioni di p-nitrofenolo che si formano in 1 minuto in ordinata in funzione della temperatura in ascisse.

Grazie mille. Quindi, è come se dovessi calcolare la quantità di p-nitrofenolo prodotto tenendo conto della curva e poi confrontarlo con quello prodotto in altre condizioni? In che modo si fa? Tipo sottraendo quello iniziale da quello finale?

Non certo facendo la sottrazione che hai detto.

Se vuoi che ti faccia un esempio di calcoli, mi devi fornire dei dati sperimentali, il protocollo dettagliato che hai eseguito e ciò che ti viene richiesto.

Ho 15 soluzioni dal volume totale di 2 mL ciascuna contenenti:

1) 2 mL di glycine buffer 0.05 M + 0.00 mL di p-nitrofenil fosfato in buffer 0.05 M pH9.5

2) 1.99 mL di glycine buffer 0.05 M + 0.01 mL di p-nitrofenil fosfato in buffer 0.05 M pH 9.5

3) 1.98 mL glycine buffer 0.05 M + 0.02 mL di p-nitrofenil fosfato in buffer 0.05 M pH 9.5

4) 1.96 + 0.04

5) 1.94 + 0.06

6) 1.92 + 0.08

7) 1.90 + 0.10

8) 1.85 + 0.15

9) 1.80 + 0.20

10) 1.60 + 0.40

11) 1.40 + 0.60

12) 1.20 + 0.80

13) 1.00 + 1.00

14) 0.50 + 1.50

15) 0.00 + 2.00

Dopo averli incubati per raggiungere 37°C, ho aggiunto 2 mL di fosfatasi alcalina 0.05 mg/mL in buffer 0.05 M a 37°C in ogni provetta a intervalli di 30 secondi. Le provette sono state incubate per 10 minuti e, cominciando dalla prima sempre a intervalli di 30 secondi, ho aggiunto 4 ml di buffer a pH 11.2 per fermare la reazione a un pH alcalino. Infine ho misurato l'assorbanza che ha qeusti valori:

1) 0

2) 0.069

3) 0.139

4) 0.275

5) 0.417

6) 0.553

7) 0.662

8) 1.079

9) 1.289

10) 2.347

11) 3.585

12) 4.165

13) 4.715

14) 6.095

15) 6.860

Quello che devo fare è calcolare la quantità di p-nitrofenolo prodotto per minuto nei 10 minuti di incubazione usando la curva di calibrazione precedentemente costruita. La curva di calibrazione che ho costruito la allego come immagine, spero sia corretta. I valori di assorbanza della curva del giorno in cui ho ottenuto i risultati scritti qui sopra sono quelli della 6 settimana.

grazie in anticipo se può aiutarmi

Mi dovresti fornire anche i dati con i quali hai costruito la curva di titolazione.

Grazie.

ecco qui

In quale unità di misura è espressa la quantità di p-nitrofenolo in ascissa della curva di calibrazione?

in mmol

Scusami, mi sono accorta ora che occorre anche la concentrazione molare della soluzione di p-nitrofenilfosfato (substrato) che hai aggiunto a volumi variabili nelle 15 soluzioni.

Altra cosa: i valori di assorbanza delle 15 soluzioni che hai misurato vanno da 0 a 6,860, cioè raggiungono valori molto elevati; inoltre i valori che vanno da 2,347 a 6,860 sono ad di fuori dell'intervallo di concentrazioni con la quale hai costruito la curva di calibrazione.

Qualcosa non mi torna

Il p-nitrofenilfosfato era 0.5 mM, le soluzioni sarebbero dovute essere 8 ma la curva di Michaelis Menten che dovevamo costruire era venuta sbagliata, quindi abbiamo incrementato la concentrazione del substrato a per avere soluzione 5mM arrivando quindi ai volumi che ho scritto prima... Per quanto riguarda i valori una mia compagna di laboratorio mi aveva suggerito di dividerli per il fattore di diluizione per renderli più piccoli, ma non verrebbe un grafico diverso se divido solo gli ultimi valori? Tra l'altro lei aveva diviso alcuni per 10, altri per 5... non sono molto sicura di questo 

Ti allego il foglio di calcolo Excel con il quale ho eseguito i calcoli con i dati da te forniti:

Come ti ho accennato ieri sera, c'è però qualcosa che non quadra perché nel grafico di Lineaweaver-Burk si ottengono dei valori di velocità massima e di costante di Michaelis-Menten negativi, il che non è possibile.

I casi sono due:

- o non ho capito io il protocollo che avete seguito

- oppure mi hai fornito dei dati sbagliati

Una cosa che non ho capito è perché avete costruito sei curve di calibrazione e, soprattutto, perché a parità di quantità di p-nitrofenolo avete ottenuto dei valori di assorbanza così diversi alla 3ª, 4ª, 5ª, 6ª settimana rispetto alla 1ª e alla 2ª settimana.

Le soluzioni di p-nitrofenilfosfato, di p-nitrofenolo e di fosfatasi alcalina le avete preparate voi mediante pesata o vi sono state fornite?

Non riesci proprio ad postare l'intero protocollo che vi è stato fornito?

Grazie mille!! Questo è un aiuto immenso  grazie grazie grazie!

Le soluzioni le abbiamo fatte tutte noi, per questo ci saranno degli errori     è possibile magari diminuire i valori come suggerito dalla mia compagna di laboratorio? Se sì, si devono dividere tutti? 

Si certo posso allegare il protocollo, ma è in inglese, per questo l'avevo scritto io (ricorda che le soluzioni del numero 4 non sono 9, ma 15 con i volumi che ho scritto prima). Se le immagini non sono chiare rifaccio le foto

È difficile, se non impossibile, per me capire dove sta l'errore nei risultati che avete ottenuto non avendo visto coi miei occhi quello che avete fatto in pratica.

Sta di fatto però che quello che è fatto è fatto, e non è possibile "aggiustare" i risultati a tavolino!!! L'unica cosa che riesco a dire è che sarebbe bene rifare tutta l'esperienza, ma credo che questo non sia possibile per voi.

Cerchiamo almeno di capire insieme se avete eseguito in modo corretto i calcoli per la preparazione delle soluzioni necessarie (a parte i tamponi che spero abbiate preparato correttamente).

Non vedo i valori delle pesate che avete effettuato realmente, perciò posso solo mostrarvi come le avrei preparate io seguendo le indicazioni del protocollo:

Soluzione di p-nitrofenolo

Soluzione madre: 0,5564 g/L = 4 mM; la pesata deve essere eseguita accuratamente su bilancia analitica

Soluzione figlia: 10 mL slz madre --> 100 mL = 0,4 mM

Soluzione di p-nitrofenilfosfato

Soluzione madre: 0,4341 g/L = 2 mM; la pesata deve essere eseguita accuratamente su bilancia analitica

Soluzione figlia: 25 mL slz madre --> 100 mL = 0,5 mM

Soluzione di fosfatasi alcalina

Soluzione madre: 0,2500 g/100 mL = 2,5 mg/mL; la pesata deve essere eseguita accuratamente su bilancia analitica

Soluzione figlia: 1,0 mL slz madre --> 50 mL = 0,05 mg/mL

N.B. Eseguendo le pesate con bilancia analitica con incertezza ±0,0001 g, per ridurre l'errore relativo sulla pesata occorre pesare masse maggiori di 0,2 g.

Curva di calibrazione

Il protocollo dice di costruire una sola curva di titolazione con quantità variabili di p-nitrofenolo.

Non ho ancora capito perché ne avete costruite sei (una ogni settimana) e con valori di assorbanza così diversi.

Qual è quella corretta???

Effetto della concentrazione del substrato sulla velocità di reazione

Il protocollo dice di preparare 9 provette aventi concentrazioni mM di p-nitrofenilfosfato che vanno da 0,00 a 0,250 mM.

Se ho capito bene, voi lo avete modificato preparando 15 aventi concentrazioni mM di p-nitrofenilfosfato che vanno da 0,00 a 2,50 mM.

Trovate i calcoli nel foglio denominato "protocollo" del seguente file:

In base all'indicazione riportata al punto (vii) del protocollo i grafici cambiano perché bisogna utilizzare la concentrazione mM di p-nitrofenilfosfato; li trovate nel seguente file:

I risultati restano comunque inaccettabili

-Nitrofenilfosfato abbiamo usato 0.00556g/30 mL (misuravamo per 30mL per coprire diversi esperimenti)

-Fosfatasi alcalina stesse quantità che hai scritto tu

-nitrofenolo abbiamo preso  0.278g, aggiunto 50 mL di buffer per fare 40 mM, poi per fare 0.4mM abbiamo preso 0.2 mL e abbiamo aggiunto 19.8 mL di buffer

Non abbiamo mai pesato quantità maggiori di quelle che ci servivano, quindi mai grandi come 0.2 g 

Per quanto riguarda la curva, ne abbiamo fatta una per settimana perchè così ci è stato detto   avendo eseguito l'esperimento ogni settimana in modo da poter confrontare la quantità di nitrofenolo prodotta ogni settimana con i nuovi risultati (ad esempio settimana 1 abbiamo eseguito l'esperimento n 1 per costruire la curva,  poi l'esperimento 3 e abbiamo calcolato la quantità di nitrofenolo usando la curva, settimana due nuove misurazione e nuova curva più esperimento 3 eseguito di nuovo, quindi nuovo confronto e così via, non so se mi sono spiegata bene).

Sicuramente abbiamo sbagliato qualcosa, ma ormai non possiamo più ripetere gli esperimenti 

Avrei un dubbio sul grafico di Lineweaver-Burk: come si calcola la KM?? E perchè Vmax e Km sono diverse, nonostante vengano calcolate con gli stessi dati, nei due diversi modi? Non dovrebbero essere uguali?

Come avete fatto a pesare 0,00556 g di p-nitrofenilfosfato??? Forse il dio della bilancia analitica lo sa

Scherzi a parte, mi è sorto il dubbio che voi abbiate pesato il sale disodico diidrato del p-nitrofenilfosfato, cioè:

(NO₂)(C₆H₄)(O)(PO)(ONa)₂ · 6H₂O MM = 371,14 g/mol

Poichè avete sciolto questa massa in 30 mL di soluzione tampone a pH 9,5, la concentrazione di questa soluzione è:

n in 30 mL = 0,00556 g / 371,14 g/mol = 1,50·10^-5 mol/30 mL

M = 1,50·10^-5 mol / 0,030 L = 4,99·10^-4 mol/L = 0,499 mmol/L = 0,50 mM

Non capisco: mi avevi detto che avevate preparato, cambiando il protocollo, una soluzione 5 mM

Non è per caso che stai confondendo il significato dei simboli???

mM = millimolare = molarità di una soluzione espressa in millimoli/L (mmol/L)

I grafici della velocità di reazione in funzione della concentrazione del substrato cambiano nuovamente:

I due grafici che permettono di verificare l'effetto della concentrazione del substrato sulla velocità di reazione devono avere il seguente andamento:

Il primo grafico [p-nitrofenolo]/min/[p-nitrofenilfosfato] mostra che, mettendo a disposizione concentrazioni via via crescenti di substrato ad una quantità costante di enzima, la quantità di prodotto che si forma nell'unità di tempo cresce inizialmente in modo proporzionale per assumere poi un andamento asintotico parallelo all'asse delle ascisse quando il sito attivo dell'enzima è stato completamente saturato dal substrato, raggiungendo così la velocità massima di reazione.

Il vostro grafico [p-nitrofenolo]/min/[p-nitrofenilfosfato] non raggiunge mai il "plateau", quindi la determinazione grafica della velocità di saturazione massima dell'enzima è molto imprecisa, di conseguenza anche il valore della Km (corrispondente alla concentrazione di substrato alla quale si ha la metà della velocità massima) che si ricava.

Il vostro grafico di Lineweaver-Burk ha un andamento lineare, ma ha intercetta negativa (-4,0817) e questo non è possibile.

L'equazione generale della retta dei doppi reciproci è:

1/V0 = (Km/Vmax) · 1/ + 1/Vmax

1/V0 = 0,4639 · 1/ - 4,0817

Quando 1/ = 0 si ha:

1/V0 = 1/Vmax

-4,0817 = 1/Vmax

da cui --> Vmax = 1/-4,0817 = -0,245 μmol p-nitrofenolo/min

pendenza della retta = Km/Vmax = 0,4639

da cui --> Km = pendenza · Vmax

Km = 0,4639 · -0,245 = -0,114 mmol p-nitrofenilfosfato/L

Ovviamente questi risultati negativi non hanno alcun senso e la ragione risiede nel fatto che il vostro enzima non è mai stato saturato completamente dal substrato.

Per quanto riguarda le 6 curve di calibrazione che avete costruito proprio non capisco come possiate aver misurato assorbanze così diverse se avete sempre pesato 0,278 g di p-nitrofenolo/50 mL, diluito 100 volte e poi fatto i diversi prelievi e letto le assorbanze